Grazie all’impiego di una piattaforma tecnologica di nuova generazione per il sequenziamento del DNA, è oggi possibile identificare rapidamente le alterazioni genetiche responsabili delle patologie oncologiche auspicando in un futuro prossimo una terapia target ad hoc per ogni singolo paziente. Presso il Dipartimento “L. e A. Seràgnoli” dell’Università di Bologna, un importante convegno organizzato in collaborazione con la Cattedra di Ematologia dell’Università di Brescia per fare il punto sui traguardi raggiunti dall’applicazione di questa tecnologia nella caratterizzazione di leucemie, linfomi, tumori solidi e trapianti e sulle sorprendenti prospettive della farmacogenomica e delle terapie personalizzate.

Bologna. Identificare le lesioni del DNA all’origine delle malattie onco-ematologiche per individuare la terapia mirata più efficace e specifica per ogni singolo paziente: un traguardo un tempo impensabile, oggi facilitato da piattaforme di sequenziamento del DNA di nuova generazione (NGS), come la tecnologia 454 di Roche, che consente la lettura multipla e parallela di singoli frammenti di DNA, passando in rassegna milioni di paia di basi in poche ore. Inoltre, grazie alla lunghezza delle sequenze prodotte facilita l’analisi dei dati, la mappatura delle sequenze e semplifica il processo di allocazione di sequenze altamente omologhe.
Grazie a questa tecnologia le alterazioni spesso microscopiche del DNA capaci di scatenare leucemie, linfomi, tumori, sono a portata di un “click” quindi individuabili in breve tempo e con procedure decisamente semplificate rispetto al sequenziamento convenzionale.
«Siamo stati tra i primi in Italia ad acquisire e usare questo nuovo sistema di sequenziamento, in grado di sequenziare massivamente il trascrittoma di una leucemia acuta linfoblastica e di ricostruire come un puzzle la sua sequenza, individuando i punti che si sono alterati – dichiara il
Professor Giovanni Martinelli dell’Università di Bologna, Dipartimento di Ematologia e Scienze Oncologiche “L. e A. Seràgnoli”, Policlinico S. Orsola-Malpighi – il sequenziamento consente di individuare non solo la lesione genetica responsabile dello scatenarsi di una leucemia, linfoma o in generale di un tumore, ma anche e soprattutto terapeuticamente suggerisce quale può essere la sua specifica cura, avendo finalmente a disposizione dei farmaci mirati in grado di colpire selettivamente l’alterazione o il danno genetico».
«Con il Professor Domenico Russo dell’Università di Brescia, inoltre, stiamo indagando le possibilità di impiego di queste tecnologie in campo trapiantologico. Esse, infatti, potenzialmente – continua Martinelli – sono in grado di fornire dati importanti ai fini della caratterizzazione HLA dei pazienti da avviare a trapianto per approfondire la conoscenza dei meccanismi di Graft Versus Leukemia (GVL) e di Graft Versus Host (GVH) e per lo studio dei meccanismi di “ escape” immunologico dei tumori».
Parlando più in generale di tumori, come rileva Annalisa Pession, Professore associato di Patologia Generale del Dipartimento di Patologia Sperimentale dell’Università di Bologna, «il sequenziamento genico si può applicare anche nel campo dei tumori solidi come quello del colon e del polmone o della mammella».

Se il sequenziamento dell’intero genoma fornisce enormi potenzialità nell’identificazione di nuove specifiche anomalie genetiche associate alla trasformazione e responsabili della progressione tumorale, per scopi diagnostici spesso è richiesta l’analisi di un numero inferiore di geni ma con un’elevata sensibilità.
Il Genome Sequencer Junior (tecnologia 454) realizzato da Roche consente, dopo “cattura” con sistemi di ibridazione o mediante amplificazione di specifiche regioni genomiche, di analizzare in un’unica “corsa” i geni specifici di malattia di più pazienti contemporaneamente e con alta risoluzione.
Conosciuto anche come “sequenziamento profondo” (deep sequencing), questa innovazione tecnologica consente di costruire una “mappa” dei geni alterati, perfezionare la diagnosi di malattia e suggerire sulla base della presenza o assenza di specifiche mutazioni l’approccio terapeutico più appropriato. Inoltre, durante il trattamento la capacità di identificare rapidamente e ad elevata sensibilità alterazioni genetiche presenti in una bassa percentuale di cellule tumorali consente di prevenire la ricaduta di malattia.
I ricercatori del gruppo del Professor Martinelli, Ilaria Iacobucci e Simona Soverini, stanno partecipando ad un importante studio europeo chiamato IRON (Interlaboratory RObustness of Next-generation sequencing) con l’obiettivo di determinare la precisione e riproducibilità di una strategia di sequenziamento profondo per la ricerca di mutazioni in geni aventi un noto ruolo nel processo di leucemogenesi e nella resistenza ai farmaci (es. TP53, BCR-ABL1, TET2, RUNX1, NOTCH1, IKZF1, etc.).
I primi risultati prodotti da questa analisi multicentrica, pubblicati sulla rivista Leukemia, hanno dimostrato che questa strategia di sequenziamento è tecnicamente fattibile, raggiunge un’alta concordanza tra molteplici laboratori e consente un’ampia e profonda caratterizzazione molecolare delle neoplasie ematologiche con un’alta sensibilità diagnostica e ha una semplice gestione, analisi e archiviazione dei dati ottenuti.
Infine, grazie all’applicazione del NGS, la farmacogenomica è ormai diventata una realtà e le ricadute positive sulla gestione della malattia da parte dei pazienti sono rilevanti.
«La possibilità di sequenziare quelle regioni genomiche implicate nella risposta ai farmaci – spiega ancora il Professor Martinelli – ci permette di identificare sia il farmaco più efficace per il singolo paziente, sia l’esatto dosaggio, la quantità del medicinale tollerata o che è opportuno che assuma, attraverso un semplice prelievo di sangue e l’identificazione di variazioni individuali naturali in geni che ricoprono un ruolo fondamentale nel metabolismo dei farmaci. La conoscenza di queste variazioni ci consente di scegliere il farmaco corretto e la giusta dose per ciascun paziente».
Una tecnologia oltremodo “intelligente”, che consente di evitare l’uso inappropriato di farmaci costosi, se inefficaci, e di risparmiare inutili effetti collaterali ai pazienti.

Next Generation Sequencing
Next Generation Sequencing, conosciuto anche come “sequenziamento profondo” (deep sequencing), è una nuova tecnologia che consente, grazie alla produzione di miliardi di sequenze di DNA in forma di corti frammenti, di costruire una “mappa” dei geni alterati nelle patologie.
Conoscere la sequenza del DNA permette di individuare le alterazioni che sono all’origine di alcune malattie genetiche o di alcuni tumori.
Grazie a questo approccio tecnologico è possibile identificare nuovi e specifici bersagli nelle cellule tumorali che possono essere efficacemente colpiti da farmaci mirati.

Una storia breve ma densa di scoperte
Fino a pochi anni fa, il sequenziamento richiedeva tempi lunghissimi e ingenti investimenti: per arrivare alla prima sequenza completa del DNA umano, ottenuta nel 2003, sono stati necessari oltre 10 anni di lavoro e più di 10 miliardi di dollari. Era poi indispensabile un’interazione perfetta tra competenze molto avanzate in Biologia molecolare e in Bioinformatica.
I primi risultati in campo oncologico risalgono al 2008, con il primo sequenziamento completo di una leucemia mieloide acuta con un corredo cromosomico (cariotipo) normale, che ha svelato la presenza di almeno 10 nuove mutazioni acquisite dalla cellula leucemica.
Sempre nello stesso anno, il sequenziamento di una linea cellulare di carcinoma del polmone a piccole cellule ha gettato le basi per lo studio del riarrangiamento genetico, ovvero di come alcuni elementi della sequenza del genoma si spostano, si cancellano o si aggiungono: sono stati identificati più di 100 riarrangiamenti tra geni dello stesso cromosoma o di cromosomi diversi.
Da allora, oltre 100 genomi tumorali sono stati sequenziati, e questo numero è in continua crescita.
Ora l’innovazione tecnologica consente di “leggere” la sequenza dei frammenti di DNA in pochi giorni e con investimenti di poche migliaia di euro.

Vantaggi e opportunità
I principali vantaggi del Sequenziamento di Nuova Generazione sono l’elevata capacità di analisi e l’altissima sensibilità, garantita dall’enorme quantità di dati e dall’accuratezza delle sequenze ottenute: la qualità e la quantità di risultati che si ottengono in mesi di lavoro tradizionale sono infatti raggiunte in unico esperimento e ciò contribuisce a un notevole abbattimento dei costi globali.
La sua applicazione consente d’identificare nel DNA nuove mutazioni, inserzioni, inversioni, riarrangiamenti, delezioni, geni di fusione, alterazioni del numero di copie e meccanismi aberranti di metilazione.
Un Next Generation Sequencing come il sistema Genome Sequencer Junior (GS Junior, Roche) offre la possibilità di sequenziare un elevato numero di frammenti di DNA con elevata capacità di definizione e produttività.
Questo sistema tecnologico è infatti in grado di assicurare la lettura multipla (100.000 letture) e parallela di singoli frammenti di DNA di lunghezza tra 400-500 basi, consentendo quindi, in un’unica corsa di analisi, di ottenere oltre 40 milioni di basi analizzate. Inoltre grazie alla lunghezza delle sequenze prodotte facilita l’analisi dei dati, la mappatura delle sequenze e semplifica il processo di allocazione di sequenze altamente omologhe.

Attuali applicazioni
Il Genome Sequencer Junior è attivo nel Laboratorio di Biologia Molecolare dell’Istituto di Ematologia
“L. e A. Seràgnoli” e presso il Laboratorio di Patologia Molecolare della Sede distaccata di Anatomia Patologica, Ospedale Bellaria, entrambi afferenti al Dipartimento di Ematologia e Scienze Oncologiche
“L. e A. Seràgnoli” dell’Università Alma Mater Studiorum di Bologna.
Nell’ambito delle attività del Dipartimento, i ricercatori stanno utilizzando il Next Generation Sequencing per:
• effettuare uno screening mutazionale altamente sensibile del gene BCR-ABL in pazienti con leucemia mieloide cronica e leucemia acuta linfoblastica Philadelphia positiva, all’esordio di malattia e durante il trattamento, al fine di prevenire una farmaco-resistenza;
• determinare e monitorare il clone leucemico mediante lo studio del riarrangiamento delle immunoglobuline;
• effettuare uno screening mutazionale altamente sensibile delle principali mutazioni che si verificano nelle leucemie acute linfoblastiche (NOTCH1, PHF6, FBXW7, IKZF1) e mieloidi (TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A, RUNX1, CBL, KRAS);
• definire con precisione i geni HLA dei pazienti per ampliare ulteriormente le conoscenze riguardo alla compatibilità tra donatore e ricevente nel trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche;
• individuare mutazioni a carico dei geni: EGFR e KRAS negli adenocarcinomi al polmone; KRAS, BRAF, HRAS, NRAS nei tumori al colon e al pancreas; BRAF nei tumori alla tiroide; BRAF e cKIT nel melanoma; IDH1 nei gliomi; TP53 nei carcinomi del cavo orale; RET nei carcinomi midollari tiroidei ereditari; SOD1 nella sindrome laterale amiotrofica;
• individuare la presenza di geni di fusione e loro varianti di EML4-ALK nei tumori al polmone;
• individuare la presenza di geni di fusione e loro varianti di PAX8-PPAR Gamma nei tumori alla tiroide;
• analizzare il profilo di espressione di RNA non codificanti tramite sequenziamento di librerie nei tumori alla mammella e del cavo orale;
• analizzare il profilo di metilazione a livello del promotore di un pannello di geni, inclusi alcuni miRNA nei gliomi e nei carcinomi squamosi del cavo orale.
Grazie ai progressi nell’ottimizzazione delle procedure e all’abbassamento dei costi che tale tecnologia consente, il Next Generation Sequencing avrà un uso sempre più estensivo in diagnostica e consentirà presto concrete applicazioni cliniche.

GLOSSARIO
ACIDO NUCLEICO Sequenza di molecole (polimero) formata da quattro monomeri, detti nucleotidi. Esistono due tipi di acidi nucleici: DNA e RNA. Sono funzionali alla sintesi delle proteine e, attraverso queste, a tutte le attività cellulari.
ALLELE Forma alternativa di un gene, responsabile di un particolare carattere ereditario. Se due alleli sono uguali tra loro, l’individuo è omozigote per quel carattere, se sono diversi è eterozigote.
AMMINOACIDO Elemento di base delle proteine. La sequenza di amminoacidi che costituisce ciascuna proteina è aggregata in base alle istruzioni del gene corrispondente. Nelle proteine umane si possono trovare fino a 20 amminoacidi diversi.
BASE AZOTATA Composto ciclico contenente azoto, nella cui molecola sono presenti uno o più anelli. Si distinguono in purine e pirimidine.Le purine sono l’Adenina (A) e la Guanina (G); le pirimidine sono la Citosina (C) e la Timina (T), tutte presenti nel DNA. Nel RNA la Timina è sostituita dall’Uracile (U).
BIOINFORMATICA Scienza interdisciplinare fondata sulla biologia, informatica, matematica e statistica per l’analisi di sequenze biologiche, dei genomi e per la predizione della funzione e della struttura di macromolecole.
BIOLOGIA MOLECOLARE Scienza che studia gli scambi che avvengono sulla superficie e all’interno della cellula, e le sostanze che sono caratteristiche del nucleo e degli organuli cellulari, in particolare la registrazione e la trasmissione delle informazioni relative all’ereditarietà.
CARATTERE Prodotto della codifica dei due geni relativi, chiamati alleli, provenienti ciascuno da uno dei due genitori e presenti sui cromosomi in posizioni omologhe, dette loci. La codifica avviene tramite la trascrizione, cioè la copia del DNA nel RNA e, nella maggior parte dei casi, nella traduzione in proteine. Un carattere si dice dominante se l’allele che lo determina è in grado di manifestarsi nella progenie e maschera la presenza dell’altro allele, che è detto recessivo. Se però l’allele recessivo è portato da entrambi i genitori, nei figli appare il carattere corrispondente. L’ereditarietà dei caratteri nella progenie è regolata dalle leggi di Mendel (leggi della ereditarietà).
CARIOTIPO Corredo o assetto cromosomico di una cellula, tipico di ogni specie. Nell’uomo comprende 23 coppie di cromosomi nucleari, 22 delle quali sono somatici non sessuali (autosomi), mentre i restanti 2 sono cromosomi sessuali (eterosomi), detti “X” e “Y” che determinano il sesso dell’individuo (XX femmina, XY maschio).
CLONE Copia identica di una molecola di DNA o RNA ottenuta replicando la molecola originaria tramite impianto all’interno di microrganismi.
CODICE GENETICO Codice mediante il quale le informazioni contenute nel DNA sono tradotte in proteine. L’ordine e la tipologia di amminoacidi che devono essere legati insieme per formare una specifica proteina sono determinati dalla sequenza del gene corrispondente.
CROMOSOMA Struttura intracellulare a forma di bastoncello. Il materiale nucleare che lo costituisce è composto da DNA e molecole proteiche ed è sede dei geni portatori dei caratteri ereditari.
CROSSING-OVER Mutazione naturale che avviene quando due cromosomi omologhi si sovrappongono e si scambiano alcuni geni.
DELEZIONE Perdita di una parte del materiale genetico; il termine può essere usato per descrivere l’area mancante sia di un gene sia di un cromosoma.
DIPLOIDE Cellula con 23 coppie di cromosomi.
DNA (acido desossiribonucleico) Lunga macromolecola (polimero) costituita da una sequenza ordinata di unità nucleotidi, composti da una base azotata, zucchero e un gruppo fosfato. Si presenta come una coppia di filamenti intrecciati tra loro a formare una struttura definita doppia elica. La disposizione in sequenza dei filamenti costituisce l’informazione genetica, leggibile attraverso il codice genetico. La lunghezza dei polimeri di DNA può essere molto elevata: ogni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi. Il DNA è identico in tutti gli individui per il 99,9%, ma il restante 0,1% fa sì che ognuno sia diverso dagli altri, con una variabilità di una base ogni mille tra individui diversi. Il primo modello di DNA a doppia elica è opera di James Watson e Francis Crick ed è stato presentato nel 1953.
EPIGENETICA Lo studio dei meccanismi responsabili di cambiamenti ereditabili nelle funzioni del genoma senza alcuna modificazione nella sequenza del DNA.
FARMACOGENETICA Branca emergente della Farmacologia che studia i fattori genetici ereditari che creano differenze tra le persone nell’azione dei farmaci, a fine di una somministrazione del farmaco basata sulle peculiarità genetiche del paziente.
FENOTIPO Insieme di tutte le caratteristiche osservabili di un organismo vivente: morfologia, sviluppo, proprietà biochimiche e fisiologiche, comprensive del comportamento, risultato dell’interazione tra espressione dei geni e fattori ambientali e casuali.
GENE Segmento di DNA disposto lungo il cromosoma responsabile dei caratteri ereditari, caratterizzato da una determinata sequenza di basi azotate, che codifica le informazioni per la produzione delle proteine, responsabili di qualsiasi reazione chimica essenziale per la vita.
GENE DI FUSIONE Gene prodotto dalla fusione di due porzioni provenienti da geni distinti, appartenenti alla stessa specie o a specie differenti e codificanti proteine diverse.
GENOMA Corredo ereditabile dei cromosomi contenuti in ogni cellula di un organismo, che include sia i geni sia il DNA non codificante, cioè non soggetto a trascrizione in RNA.
GENOTIPO Patrimonio genetico immutabile di un individuo, ovvero l’insieme delle sequenze di DNA specifiche di un organismo. Ogni cellula contiene, in linea generale, l’intero genoma dell’organismo stesso.
HLA (Human Leucocyte Antigen, antigene leucocitario umano) Insieme di molecole presenti sulla superficie dei leucociti e di altre cellule, chiamate anche antigeni d’istocompatibilità. Sono responsabili della compatibilità tissutale, cioè della accettazione di organi provenienti da un altro organismo.
INVERSIONE Mutazione cromosomica cioè di un lungo tratto di DNA, che consiste nella rottura del filamento di DNA in due punti; il frammento così ottenuto è reincorporato, grazie alla riparazione a opera di specifici enzimi nel cromosoma, ma viene invertito d’orientamento.
MITOCONDRI Organelli intracellulari, identificati per la prima volta da Cowdry nel 1918, deputati per lo più alla produzione di energia. Sono dotati di quattro compartimenti: la membrana esterna, la membrana interna, lo spazio intermembrana e la matrice.
MONOMERO Molecola semplice in grado di combinarsi con altre molecole a formare un polimero.
MUTAZIONE Inserzione, sostituzione o delezione di una delle quattro basi azotate in alcune posizioni della sequenza del DNA di un gene da cui prende origine una forma alternativa. Una mutazione che altera non solo la base azotata, ma anche la funzione del gene, dà origine a una malattia genetica.
NUCLEOTIDE Composto organico costituito da uno zucchero a cinque atomi di carbonio legato a una base azotata e a un gruppo fosfato. I diversi nucleotidi differiscono soltanto per la base azotata. Possono essere considerate le lettere dell’alfabeto sulla Terra: il corredo genetico delle cellule è espresso come una sequenza di nucleotidi.
METILAZIONE DEL DNA Modificazione epigenetica del DNA che altera i geni che la subiscono. Il processo consiste nel legame di un gruppo metile (-CH3) a una base azotata: questo processo è correlato all’inattivazione di una particolare regione di DNA. Modelli di DNA metilato sono stati evidenziati nelle cellule tumorali. I modelli anormali di metilazione del DNA sono stati associati a un gran numero di neoplasie umane e si trovano in due forme distinte: ipermetilazione e ipometilazione rispetto al tessuto normale.
NUCLEO Parte centrale di una cellula in cui sono contenuti i cromosomi.
NUCLEOTIDE Monomero costituente degli acidi nucleici formato da un gruppo fosforico, uno zucchero pentoso (a cinque atomi di carbonio) e da 1 delle 4 basi azotate.
POLIMERO Sequenza di molecole più piccole, dette monomeri.
PROTEINE Macromolecole costituite da sequenze dei 20 aminoacidi presenti in natura. Sono dei composti fondamentali per la cellula e svolgono funzioni strutturali, regolative ed enzimatiche.
RIARRANGIAMENTO Spostamento fisico di sequenze del genoma presenti all’interno del nucleo cellulare che formano nuove combinazioni, dette ricombinazioni. Quando tali ricombinazioni interessano i cromosomi si parla di riarrangiamento cromosomico, se invece interessano i geni prendono il nome di riarrangiamenti genetici.
RNA (acido ribonucleico) Polimero a singolo filamento il cui compito principale è di trascrivere e tradurre l’informazione contenuta nel DNA nella struttura delle proteine. Le molecole di RNA differiscono da quelle di DNA perché contengono lo zucchero ribosio e una delle basi, la Timina (T) è sostituita dall’Uracile (U).
RNA MESSAGERO (mRNA) Tipo di RNA che codifica e porta informazioni durante la trascrizione dal DNA ai siti della sintesi proteica, per essere sottoposto alla traduzione.
SEQUENZA D’INSERZIONE (IS) Filamento di DNA a doppia elica costituito generalmente da circa 800-900 coppie di basi. È costituita da una porzione centrale che contiene dei geni funzionali, che codificano per gli enzimi necessari alla trasposizione, fiancheggiata da due sequenze di basi corte, ripetute invertite, che non codificano per nessun enzima e sono disposte specularmente alle due estremità.
SEQUENZIAMENTO DEL DNA Processo di determinazione dell’ordine delle basi lungo l’elica di DNA, che include diversi metodi e svariate tecnologie. Uno degli obiettivi fondamentali del sequenziamento è quello di identificare i geni. Per mappare il genoma umano è stata usata la metodica di sequenziamento tramite shotgun, che fa uso di enzimi che tagliano il DNA in centinaia o migliaia di unità random, sequenziati e riassemblati tramite computer.
SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE Nuova tecnologia che consente, grazie alla produzione di miliardi di sequenze di DNA in forma di corti frammenti, di “leggerle” in pochi giorni e con investimenti contenuti. Grazie a questo nuovo approccio tecnologico è possibile identificare nuovi e specifici bersagli nelle cellule tumorali che possono essere efficacemente colpiti da farmaci mirati.
TRADUZIONE GENETICA Anche detta sintesi proteica, è il processo biochimico attraverso il quale l’informazione genetica contenuta nel RNA messaggero (mRNA) viene convertita in proteine che svolgono un’ampia gamma di funzioni nella cellula.
TRAPIANTO ALLOGENICO Si realizza quando donatore e ricevente dell’organo sono due persone diverse.
TRAPIANTO AUTOLOGO Si realizza quando donatore e ricevente sono la stessa persona.
TRASCRITTOMA è l’insieme di tutti i trascritti (RNA messaggeri o mRNA) di un dato organismo o tipo cellulare.
TRASCRIZIONE Processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA.
TRASLOCAZIONE Tipo di mutazione cromosomica derivata da un errato scambio di parti di cromosomi non omologhi durante il riarrangiamento cromosomico. Si distingue in reciproca, quando lo scambio di materiale genetico è tra cromosomi non omologhi, e robertsoniana, che consiste nella fusione di due cromosomi a livello del centromero, con conseguente perdita del braccio corto.
TRASPOSONI. Alcuni elementi genetici presenti nei cromosomi capaci di spostarsi da una posizione all’altra del genoma.

Giovanni Martinelli: il futuro è iniziato
Professor Martinelli, per introdurci all’argomento, potrebbe illustrarci cos’è un’informazione genetica e cos’è un sequenziamento di nuova generazione?
Ogni gene è formato da una sezione molecolare di DNA e contiene una sequenza di coppie di basi azotate (Adenina, Citosina, Guanina e Timina): la disposizione in sequenza di queste quattro basi costituisce l’informazione genetica, cioè i dati ereditari alla base dello sviluppo di tutti gli organismi viventi. Un singolo cromosoma può arrivare a contenere più di 250 milioni di coppie di basi, mentre l’intero genoma umano, secondo alcune stime, è costituito da circa 3 miliardi di coppie di basi.
Il sequenziamento del DNA determina l’ordine delle quattro basi azotate e permette di “leggere” il DNA e dunque le lesioni genetiche. La mappatura del genoma umano ci serve come modello per allineare ciascuno dei frammenti del DNA del paziente rispetto al modello. Usiamo 1.000 genomi sequenziati, che adoperiamo come modelli di riferimento per il confronto computerizzato dei frammenti del DNA del paziente.

Quali vantaggi apporta il Next Generation Sequencing rispetto alle procedure utilizzate in passato?
Senza questa tecnologia la ricerca delle alterazioni e delle distruzioni genetiche sarebbe assai difficile, come cercare in un albergo, stanza per stanza, quella dove c’è una perdita d’acqua; al contrario, riusciamo a risequenziare massivamente il genoma umano e mediante frammenti come in un puzzle ad individuare i punti che si sono alterati.
Un Next Generation Sequencing come il Genome Sequencer Junior (tecnologia 454), realizzato da Roche e in dotazione presso il nostro Centro, consente la lettura multipla e parallela di oltre centomila singoli frammenti di DNA, di lunghezza media compresa fra 400 e 500 paia di basi: ciò significa che in sole 10 ore si possono leggere circa 40-50 milioni di paia di basi.
Siamo stati i primi a utilizzare questo nuovo sistema di sequenziamento, che ha il vantaggio di permettere anche al medico, non più solo al biologo, di focalizzare l’attenzione sui punti alterati del genoma dei singoli individui, con un costo e una spesa di energie umane, in termini di tempo, decisamente limitate.

Le terapie personalizzate, in special modo nel campo delle leucemie, oggi rappresentano un obiettivo primario: che contributo offre il sequenziamento genetico per individuare la risposta del corpo umano ai farmaci?
È ormai chiaro che i tumori e le leucemie sono patologie che riconoscono nella lesione genetica sul DNA la loro causa: le lesioni genetiche possono essere macroscopiche, come la perdita di un intero cromosoma, ma molto più frequentemente sono microscopiche, piccolissime lesioni di una sola o poche basi, che ci impongono di sequenziare il genoma umano.
Costruire una “mappa” dei geni alterati nelle malattie è il primo passo per capirle e curarle.
Il sequenziamento consente di individuare non solo la lesione genetica di ciascun individuo, ma anche e soprattutto quale può essere la sua specifica cura, avendo finalmente a disposizione dei farmaci target in grado di colpire selettivamente l’alterazione o il danno genetico.
In tal modo la guarigione o la remissione della malattia finiscono per incidere molto meno sul paziente, in termini di tossicità, ricoveri prolungati, sofferenza.

Chiunque può beneficiare dei risultati raggiunti dal sequenziamento del DNA?
L’individuazione delle mutazioni nel cancro della mammella, del polmone e del colon è finalmente diventato un must nelle procedure diagnostiche e rappresenta ormai una necessità etica, indifferentemente dall’età e dallo stato di malattia del soggetto. L’attenzione è rivolta in primis verso il settore pediatrico, ma nel paziente anziano la ricerca delle alterazioni genetiche è ancor più necessaria, perché più fragile per età e comorbilità e quindi non in grado di giovarsi dell’intensificazione delle cure, fino ad oggi essenziale nella cura, ad esempio, della leucemia.
Peraltro, questa procedura, che fino a qualche anno fa era estremamente costosa, oggi è accessibile a un costo decisamente minore rispetto a molte delle metodiche per analizzare le forme neoplastiche utilizzate di routine.

Quali sono i vantaggi offerti dal sequenziamento di nuova generazione allo sviluppo di una medicina personalizzata?
Tutti noi siamo allergici o ipersensibili a certi farmaci e come li assorbiamo e li metabolizziamo è scritto nel nostro genoma: sono infatti circa 140.000 le reazioni avverse che si verificano ogni mese solo in Italia.
Lo sviluppo della farmacogenomica sulla base dell’analisi dell’intero genoma ci permette di identificare sia il farmaco specificamente efficace per la singola persona, sia l’esatto dosaggio, la quantità del medicinale che il paziente può tollerare o che è opportuno che assuma e questo attraverso un test, da eseguire una sola volta nella vita.
Attraverso un semplice prelievo di sangue s’identificano alcune variazioni individuali naturali (chiamate polimorfismi) di geni che ricoprono un ruolo fondamentale nel metabolismo dei farmaci. La conoscenza di queste variazioni consente di scegliere il farmaco corretto e la giusta dose per quel tipo di paziente.

Il sequenziamento di nuova generazione può darci delle soluzioni anche nel caso di resistenza ai farmaci?
Il sequenziamento è estremamente vantaggioso anche per la ricerca sulla resistenza ai farmaci, un problema che ha dimensioni estese, come dimostra la battaglia che si sta portando avanti negli ospedali contro i ceppi di batteri farmaco-resistenti. Sequenziare il germe, invece di coltivarlo, ci permette di identificare immediatamente i geni della farmaco-resistenza: nel Convegno vi sarà una piccola sessione dedicata alla microbiologia, che è il futuro.

Quanto incide l’evoluzione tecnologica determinata dal Next Generation Sequencing nel campo dei trapianti del midollo osseo?
L’applicazione di NGS in campo trapiantologico è estremamente innovativa e potenzialmente utile a chiarire i meccanismi con cui si realizza la “GVL”, ovvero la reazione contro il tumore, effetto positivo e curativo del trapianto, oppure, la “GVH”, ovvero, la reazione del trapianto contro organi e tessuti del paziente, effetto negativo e pericoloso per la vita del paziente stesso. Per questo progetto e per le altre linee di ricerca, desidero sottolineare l’intensa collaborazione scietifica con il gruppo di ricerca del Professor Domenico Russo dell’Università di Brescia.

Annalisa Pession: lotta ai tumori solidi e alle leucemie
Quali vantaggi comporta il sequenziamento di nuova generazione nella lotta alle leucemie e ai tumori solidi?
Le piattaforme di Next Generation Sequencing (NGS) rappresentano un punto di svolta nella ricerca biomedica, in quanto ci permettono di raggiungere più agevolmente un duplice obiettivo: caratterizzare sempre di più le alterazioni di alcune neoplasie che sono già descritte e rivestono un ruolo importante sotto il profilo diagnostico, e scoprire alterazioni ancora non identificate che in una prospettiva di ricerca possono diventare bersaglio di nuove terapie. Il NGS ci consente infatti di individuare sia la presenza di alterazioni genetiche ereditarie, le cosiddette mutazioni costitutive, che predispongono il soggetto allo sviluppo di tumori, sia i marcatori genici tumorali, in grado di predire quale sarà l’andamento della malattia o la risposta a una determinata terapia.
Trovare nuove alterazioni genetiche si traduce nella possibilità d’individuare nuovi bersagli di cura. Inoltre, avere strumenti sempre più sensibili ci consente di pensare in modo preventivo alle neoplasie, individuarle cioè sempre più in anticipo, e di capire meglio i passaggi chiave nel complesso processo di trasformazione caratteristico dei tumori.
 
Lei lavora sulle alterazioni genetiche dei tumori solidi: può farci qualche esempio delle ricadute della ricerca sulle possibilità di cura?
A differenza dei tumori del sistema ematopoietico, le anomalie cromosomiche dei tumori solidi sono più eterogenee e non sempre chiaramente associate alla patogenesi del tumore. L’importanza di identificare le mutazioni genetiche risiede nel fatto che esistono delle terapie specifiche con farmaci che sono efficaci o meno a seconda che siano presenti determinate mutazioni, come la mutazione della proteina KRAS per il carcinoma del colon, quella di EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) per i tumori del polmone o le mutazioni dell’oncogene BRAF per i melanomi.
Ad esempio, se nel polmone è presente la mutazione di EGFR possono essere somministrate delle molecole che sono terapeuticamente attive mentre, al contrario, se viene rilevata la mutazione di KRAS, alcuni farmaci per il carcinoma del colon non possono essere utilizzati.
La ricerca delle alterazioni genetiche ci consente dunque anche di evitare di utilizzare farmaci costosi, se inefficaci, risparmiando inutili effetti collaterali ai pazienti.

Quali vantaggi ha comportato l’utilizzo del Next Generation Sequencing nell’attività del suo laboratorio anche rispetto al sequenziamento tradizionale?
Il nostro laboratorio fa ricerca sulla diagnostica dei tumori solidi e utilizziamo Genome Sequencer Junior (tecnologia 454 – Roche) da un anno, per cui abbiamo accumulato una discreta esperienza.
Il vantaggio che offre questa piattaforma di nuova generazione è una maggiore sensibilità nell’individuare alterazioni specifiche dei geni nei tumori. Ci permette inoltre di vedere ulteriori alterazioni che sono caratteristiche dei tumori, come particolari riarrangiamenti a livello del DNA. La maggior parte delle strumentazioni più comunemente utilizzate nei laboratori identificano alcune mutazioni specifiche di EGFR, mentre questo strumento è in grado di identificarne anche di rare o non ancora caratterizzate in letteratura.
Inoltre, con la medesima “corsa”, la macchina ci permette di analizzare più geni e di studiare più pazienti contemporaneamente, con ricadute positive in termini di riduzione dei tempi di risposta e ottimizzazione delle risorse umane e dei costi.
Infine, a differenza della ricerca sulle leucemie, spesso il nostro materiale di studio proviene da esami citologici o bioptici che rendono disponibili solo poche cellule: un ulteriore vantaggio di questa piattaforma è che la quantità ridotta del materiale studiato non costituisce un limite.

Può parlarci del progetto di ricerca che la vede attualmente impegnata con l’ausilio di un sequenziamento di nuova generazione?
Uno dei campi che avrà a breve una ricaduta nell’inquadramento clinico dei tumori è studiare dei microRNA, ovvero RNA con sequenze molto corte, che risultano alterati in caso di neoplasie e sono molto importanti perché hanno la funzione di controllare l’espressione dei geni nel tumore. Diversi studi dimostrano che nelle cellule tumorali il profilo di espressione di certi microRNA è diverso rispetto alle cellule sane corrispondenti e che molte cellule tumorali, altrimenti indistinguibili da quelle sane, siano identificabili confrontando tale profilo.
Attualmente, ancora poco si conosce sulla loro effettiva espressione nei tumori solidi. Il nostro intento è quello di studiare il profilo di espressione di specifici microRNA in neoplasie solide, con particolare attenzione ai tumori della mammella e cerebrali.